Xác định Auramine O trong thực phẩm bằng LC-MS/MS

Xác định Auramine O trong thực phẩm bằng LC-MS/MS là phương pháp phân tích có độ chọn lọc và độ nhạy cao, phù hợp để phát hiện chất vàng ô ở nồng độ vết trong các nền mẫu phức tạp. Quy trình sử dụng acetonitrile acid hóa để chiết Auramine O, kết hợp muối QuEChERS và vật liệu làm sạch phân tán dSPE trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần.

Theo phương pháp tham khảo, giới hạn phát hiện LOD đạt 0,3 µg/kg và giới hạn định lượng LOQ đạt 1,0 µg/kg. Các thông số này cần được phòng thí nghiệm xác nhận hoặc thẩm định lại trên từng nền mẫu, thiết bị LC-MS/MS và điều kiện vận hành thực tế.

Auramine O là gì?

Auramine O còn được biết đến với các tên gọi như Auramine, Basic Yellow 2, vàng ô hoặc chất vàng O. Đây là một chất màu tổng hợp thuộc nhóm diarylmethane, thường được sử dụng trong công nghiệp nhuộm, sản xuất giấy và một số quy trình nhuộm huỳnh quang trong phòng thí nghiệm.

Auramine O không nên được xem là chất tạo màu thông thường dùng trong thực phẩm. Việc kiểm nghiệm chất này có ý nghĩa đối với phòng thử nghiệm thực phẩm, đơn vị QA/QC, doanh nghiệp chế biến, cơ sở xuất khẩu và cơ quan quản lý chất lượng.

Các nền mẫu có thể được xem xét kiểm nghiệm gồm:

• Thủy sản và sản phẩm thủy sản chế biến.
• Thịt, da động vật và thức ăn chăn nuôi.
• Rau củ muối chua và thực phẩm lên men.
• Gia vị và sản phẩm có màu vàng.
• Nông sản, trái cây và thực phẩm chế biến.

Mỗi nền mẫu có thành phần protein, chất béo, đường, muối và sắc tố khác nhau. Vì vậy, độ thu hồi, hiệu ứng nền, độ lặp lại, LOD và LOQ phải được đánh giá riêng trước khi áp dụng phương pháp thường quy.

Đối với nền trái cây, bạn có thể tham khảo thêm bài viết phân tích Auramine O trong sầu riêng bằng LC-MS/MS tại ICG Scitech.

Vì sao nên phân tích Auramine O bằng LC-MS/MS?

Nền mẫu thực phẩm thường chứa protein, lipid, đường, sắc tố tự nhiên, acid hữu cơ, muối và nhiều hợp chất đồng chiết. Những thành phần này có thể gây nhiễu, làm thay đổi tín hiệu hoặc dẫn đến kết quả không chính xác nếu phương pháp không có đủ độ chọn lọc.

LC-MS/MS kết hợp hai quá trình:

1. Sắc ký lỏng: tách Auramine O khỏi các thành phần khác trong dịch chiết mẫu.
2. Khối phổ hai lần: nhận diện chất phân tích thông qua ion mẹ và các ion con đặc trưng.

Khi vận hành ở chế độ MRM, hệ thống có thể theo dõi một chuyển tiếp ion định lượng và một chuyển tiếp ion định tính. Điều này giúp tăng độ tin cậy khi phát hiện và xác nhận Auramine O.

Ưu điểm của phương pháp LC-MS/MS

• Độ chọn lọc cao đối với nền thực phẩm phức tạp.
• Có khả năng phát hiện Auramine O ở nồng độ thấp.
• Hỗ trợ đồng thời ion định lượng và ion xác nhận.
• Thời gian phân tích tương đối ngắn.
• Có thể kiểm soát thời gian lưu và tỷ lệ ion.
• Phù hợp với các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.
• Có khả năng mở rộng sang nhiều nền mẫu sau khi xác nhận phương pháp.

Phạm vi và giới hạn của phương pháp

Các giá trị trên mang tính tham khảo theo tài liệu phương pháp. Phòng thí nghiệm phải xác nhận độ đúng, độ chụm, độ chọn lọc, hiệu ứng nền, độ ổn định, LOD và LOQ trên hệ thống đang sử dụng trước khi ban hành SOP chính thức.

Nguyên tắc xác định Auramine O bằng LC-MS/MS

Mẫu được đồng nhất, sau đó Auramine O được chiết bằng acetonitrile có bổ sung acid acetic. Dịch chiết được phân lớp bằng hỗn hợp magnesium sulfate và sodium chloride.

Một phần pha acetonitrile được tiếp tục làm sạch bằng magnesium sulfate và vật liệu C18. Sau khi ly tâm, dịch chiết được lọc qua màng 0,22 µm và chuyển vào vial để phân tích bằng LC-MS/MS.

Quy trình có đặc điểm tương tự phương pháp QuEChERS kết hợp làm sạch phân tán dSPE, giúp:

• Tách nước khỏi pha acetonitrile.
• Loại một phần lipid và thành phần kỵ nước.
• Giảm lượng chất nền đi vào hệ thống LC-MS/MS.
• Hạn chế nhiễu nền và tình trạng bẩn nguồn ion.
• Cải thiện độ ổn định của quá trình định lượng.

Hóa chất và vật tư cần sử dụng

Hóa chất Merck/Supelco có thể tham khảo tại ICG Scitech

Phòng thí nghiệm có thể xem thêm danh mục hóa chất và vật tư quang phổ khối Merck để lựa chọn dung môi, phụ gia pha động, cột sắc ký và vật tư xử lý mẫu phù hợp.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Auramine O

Dung dịch chuẩn gốc 1.000 mg/L

Cân chính xác 10,0 mg chất chuẩn Auramine vào bình định mức 10 mL. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile.

Dung dịch nên được chứa trong chai thủy tinh tối màu và bảo quản theo hướng dẫn trên COA/SDS của chất chuẩn. Tài liệu phương pháp đề xuất bảo quản ở nhiệt độ không cao hơn -18°C và thời hạn tối đa một năm. Phòng thí nghiệm cần xác nhận độ ổn định thực tế trước khi áp dụng.

Dung dịch chuẩn trung gian

• 100 mg/L: pha loãng thích hợp từ dung dịch chuẩn gốc 1.000 mg/L bằng acetonitrile.
• 1 mg/L: pha loãng dung dịch 100 mg/L bằng acetonitrile.
• 100 µg/L: pha loãng từ dung dịch chuẩn 1 mg/L.
• 10 µg/L: pha loãng từ dung dịch chuẩn 100 µg/L.

Các dung dịch chuẩn làm việc ở nồng độ thấp nên được pha trong ngày và bảo vệ khỏi ánh sáng.

Các điểm đường chuẩn

Đối với nền mẫu có hiệu ứng nền đáng kể, phòng thí nghiệm nên đánh giá việc sử dụng đường chuẩn nền matrix-matched hoặc phương pháp thêm chuẩn thay cho đường chuẩn dung môi.

Thiết bị và dụng cụ

• Hệ thống LC-MS/MS và phần mềm xử lý dữ liệu.
• Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước tham khảo 50 × 2,1 mm, cỡ hạt 1,7 µm.
• Cân phân tích có khả năng đọc đến 0,1 mg.
• Máy ly tâm cho ống 50 mL.
• Máy ly tâm tốc độ cao cho ống 1,5 mL.
• Máy vortex.
• Bể siêu âm.
• Micropipette và đầu típ phù hợp.
• Bình định mức cấp chính xác phù hợp.
• Ống ly tâm polypropylene 50 mL và 1,5 mL.
• Syringe và màng lọc 0,22 µm.
• Vial và nắp vial tương thích với LC-MS.

Chuẩn bị và xử lý mẫu

Đồng nhất mẫu

Mẫu phải được lấy đại diện, bảo quản phù hợp và đồng nhất trước khi phân tích. Mẫu được xay hoặc nghiền bằng thiết bị sạch, không chứa hoặc không gây nhiễm chất cần phân tích.

Đối với thủy hải sản, việc lựa chọn phần mẫu thử phải phù hợp với mục tiêu kiểm nghiệm và quy định lấy mẫu. Mẫu cá béo, nội tạng hoặc sản phẩm tẩm ướp có thể cần đánh giá thêm khả năng loại lipid của bước làm sạch.

Mẫu trắng và mẫu kiểm soát

Mẫu trắng là mẫu nền đã được xác định không chứa Auramine O và được xử lý giống mẫu thử. Mẫu trắng được dùng để đánh giá nhiễm nền, nhiễm chéo và chuẩn bị mẫu thêm chuẩn.

Để chuẩn bị mẫu kiểm soát ở mức 1,0 µg/kg, cân 5,00 ± 0,01 g mẫu trắng, bổ sung lượng dung dịch chuẩn phù hợp, vortex và để yên khoảng 15 phút trước khi chiết.

Quy trình chiết và làm sạch Auramine O

Bước 1: Cân mẫu

Cân chính xác 5,00 ± 0,01 g mẫu vào ống ly tâm polypropylene 50 mL.

Bước 2: Bổ sung nước

Thêm 2 mL nước và vortex trong khoảng một phút. Bước này giúp phân tán và hydrat hóa nền mẫu trước khi chiết bằng dung môi hữu cơ.

Nếu SOP yêu cầu kiểm soát nền dung môi ở mức thấp, có thể tham khảo Water LC-MS Merck 1.15333 .

Bước 3: Chiết bằng acetonitrile acid hóa

Thêm 10 mL acetonitrile chứa 1% acid acetic. Vortex đến khi mẫu được phân tán hoàn toàn, sau đó siêu âm trong khoảng 20 phút.

Acetonitrile acid hóa hỗ trợ giải phóng Auramine O khỏi nền và hạn chế đồng chiết một số thành phần không mong muốn.

Bước 4: Phân lớp bằng muối

Thêm 5 g hỗn hợp M1 gồm:

Magnesium sulfate : Sodium chloride = 4 : 1

Đậy kín ống, lắc mạnh, vortex trong một phút và tiếp tục siêu âm khoảng 20 phút. Ly tâm ở 3.500 vòng/phút trong 5 phút.

Magnesium sulfate khan hấp thụ nước, trong khi sodium chloride hỗ trợ đưa chất phân tích vào pha acetonitrile thông qua hiệu ứng salting-out.

Bước 5: Làm sạch dSPE

Chuyển khoảng 1,2 mL lớp acetonitrile vào ống ly tâm 1,5 mL đã chứa khoảng 0,25 g hỗn hợp M2:

Magnesium sulfate : C18 = 9 : 3

Vortex trong một phút, sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút.

C18 hỗ trợ giữ lại lipid và một số hợp chất kỵ nước, trong khi magnesium sulfate tiếp tục loại lượng nước còn lại.

Bước 6: Lọc mẫu

Lọc lớp dịch trong qua màng lọc 0,22 µm vào vial LC-MS. Dịch chiết sau làm sạch được sử dụng để phân tích bằng LC-MS/MS.

Điều kiện phân tích LC-MS/MS tham khảo

Điều kiện sắc ký lỏng

Để chuẩn bị pha động phù hợp với detector khối phổ, có thể tham khảo:

• Water LC-MS Merck 1.15333 – nước LC-MS LiChrosolv® .
• Acetonitrile LC-MS Merck 1.00029 – hypergrade LiChrosolv® .
• Ammonium acetate LC-MS Merck 5.33004 – LiChropur™ .

Chương trình gradient pha động

Điều kiện đầu dò khối phổ

Chuyển tiếp ion MRM của Auramine O

Các thông số nguồn, điện áp và năng lượng va chạm phụ thuộc vào thiết kế của từng hệ LC-MS/MS. Khi chuyển phương pháp sang thiết bị khác, cần tuning và tối ưu lại để đạt độ nhạy, hình dạng peak và tỷ lệ ion phù hợp.

Trình tự chạy mẫu LC-MS/MS

1. Mẫu trắng dung môi.
2. Đường chuẩn gồm bảy điểm.
3. Chuẩn kiểm soát QCS.
4. Mẫu trắng kiểm soát.
5. Mẫu kiểm soát thêm chuẩn.
6. Phân tích từ 10 đến 15 mẫu thử.
7. Tiêm lại chuẩn kiểm soát QCS.
8. Lặp lại nhóm mẫu và QCS đến khi kết thúc batch.

Nên bố trí thêm mẫu trắng sau chuẩn nồng độ cao để đánh giá carry-over nếu hệ thống hoặc chất phân tích có nguy cơ lưu mẫu.

Kiểm soát chất lượng kết quả

Độ tuyến tính của đường chuẩn

Đường chuẩn phải đạt R ≥ 0,995 hoặc R² ≥ 0,99. Độ chệch nồng độ tính ngược của từng điểm chuẩn không vượt quá 15%, trừ khi SOP có quy định riêng đối với điểm chuẩn thấp nhất.

Chuẩn kiểm soát QCS

Sai lệch của chuẩn kiểm soát trong suốt quá trình phân tích không vượt quá ±10%. Nếu QCS không đạt, cần đánh giá lại sự ổn định của hệ thống, đường chuẩn, pha động và toàn bộ batch phân tích.

Thời gian lưu

Sai khác thời gian lưu của Auramine O trong cùng một đợt phân tích không vượt quá ±2,5%.

Mẫu trắng

Tại thời gian lưu của Auramine O không được xuất hiện peak nhiễu đáng kể. Kết quả mẫu trắng phải thấp hơn hoặc bằng LOD của phương pháp.

Độ thu hồi

Mẫu kiểm soát bổ sung chuẩn tại mức LOQ phải có độ thu hồi trong khoảng 60–115%. Khoảng chấp nhận cần được xem xét theo phương pháp tham chiếu, nền mẫu và hệ thống quản lý chất lượng của phòng thí nghiệm.

Mẫu phân tích lặp

Trong mỗi đợt phân tích, tối thiểu 10% số mẫu nên được phân tích lặp. Độ sai lệch tương đối giữa hai kết quả được đánh giá thông qua chỉ số %RPD.

Cách tính hàm lượng Auramine O

Hàm lượng Auramine O trong mẫu có thể được tính theo công thức:

M = (C_dc × V_dm × f) / m_m

Trong đó:

• M: hàm lượng Auramine O trong mẫu, µg/kg.
• C_dc: nồng độ Auramine O tính từ đường chuẩn, µg/L.
• V_dm: thể tích dịch chiết hoặc thể tích định mức, mL.
• f: hệ số pha loãng, nếu có.
• m_m: khối lượng mẫu, g.

Ví dụ: kết quả dịch chiết là 0,5 µg/L, thể tích chiết 10 mL, khối lượng mẫu 5 g và không pha loãng thêm:

M = 0,5 × 10 / 5 = 1,0 µg/kg

Công thức sử dụng thực tế phải phản ánh đầy đủ các bước chiết, định mức, cô đặc hoặc pha loãng trong SOP của phòng thí nghiệm.

Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả

Chất lượng dung môi LC-MS

Dung môi có nền ion cao, tạp chất hoặc cặn không bay hơi có thể làm tăng nhiễu, giảm độ nhạy và gây bẩn nguồn khối phổ. Đối với pha động đưa trực tiếp vào detector, nên sử dụng đúng cấp LC-MS theo yêu cầu của phương pháp.

Tham khảo Acetonitrile LC-MS Merck 1.00029 và Water LC-MS Merck 1.15333 để đồng bộ nền dung môi cho pha động.

Hiệu ứng nền

Các thành phần đồng chiết có thể làm tăng hoặc giảm tín hiệu ion của Auramine O. Có thể đánh giá hiệu ứng nền bằng cách so sánh:

• Chuẩn pha trong dung môi.
• Chuẩn bổ sung vào dịch chiết sau xử lý.
• Đường chuẩn nền matrix-matched.
• Mẫu thêm chuẩn trước khi chiết.

Nhiễm chéo

Auramine có màu mạnh và có thể gây nhiễm chéo từ dụng cụ, dung dịch chuẩn hoặc khu vực pha chuẩn. Phòng thí nghiệm nên:

• Pha chuẩn tại khu vực riêng.
• Sử dụng đầu típ mới cho từng thao tác.
• Kiểm tra blank sau chuẩn nồng độ cao.
• Vệ sinh bề mặt và dụng cụ sau khi pha chuẩn.
• Không dùng chung dụng cụ pha chuẩn với mẫu trắng.

Độ ổn định của dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn làm việc ở nồng độ thấp nên được pha trong ngày. Chai chuẩn cần được hạn chế tiếp xúc với ánh sáng và bảo quản theo COA của nhà sản xuất.

Phòng thí nghiệm có thể tham khảo thông tin Auramine analytical standard Merck 51362 để lựa chọn và quản lý chất chuẩn phù hợp.

Có thể áp dụng phương pháp cho mẫu thủy hải sản không?

Có thể sử dụng quy trình này làm cơ sở tham khảo cho mẫu thủy hải sản, nhưng không nên mặc nhiên xem phương pháp đã phù hợp với mọi loại mẫu.

Nền thủy hải sản có thể chứa hàm lượng protein, lipid, muối và sắc tố khác nhau. Đặc biệt, cá béo, nội tạng, sản phẩm tẩm ướp hoặc thủy sản chế biến có thể tạo hiệu ứng nền mạnh.

Trước khi áp dụng thường quy, phòng thí nghiệm cần đánh giá:

• Độ thu hồi trên từng nền mẫu.
• Hiệu ứng nền và khả năng ức chế ion.
• Độ lặp lại và độ tái lập.
• Tính chọn lọc của chuyển tiếp MRM.
• LOD và LOQ thực tế.
• Khả năng loại lipid của bước làm sạch C18.
• Sự cần thiết của PSA hoặc vật liệu dSPE khác.
• Độ ổn định của Auramine O trong quá trình bảo quản mẫu.

Câu hỏi thường gặp về xác định Auramine O bằng LC-MS/MS

Auramine O có phải phụ gia thực phẩm không?

Không nên xem Auramine O là phụ gia tạo màu thông thường dùng trong thực phẩm. Đây là chất màu công nghiệp cần được kiểm soát bằng phương pháp có độ chọn lọc phù hợp khi xuất hiện nghi ngờ trong mẫu thực phẩm.

LC-MS/MS có ưu điểm gì khi phân tích Auramine O?

LC-MS/MS giúp tách chất phân tích khỏi nền mẫu và nhận diện thông qua các chuyển tiếp ion MRM đặc trưng. Phương pháp có độ chọn lọc cao, phù hợp để xác định Auramine O ở nồng độ thấp trong nền thực phẩm phức tạp.

Có bắt buộc sử dụng dung môi LC-MS grade không?

Đối với pha động đưa trực tiếp vào detector khối phổ, nên sử dụng nước, acetonitrile, formic acid và phụ gia đúng cấp LC-MS theo yêu cầu của SOP. Dung môi không phù hợp có thể làm tăng blank, giảm độ nhạy hoặc gây tích tụ cặn trong nguồn ion.

Có thể thay cột C18 khác không?

Có thể khảo sát cột C18 có kích thước và đặc tính tương đương. Tuy nhiên, khi thay cột cần kiểm tra lại thời gian lưu, hình dạng peak, áp suất, độ phân giải, hiệu ứng nền và các tiêu chí phù hợp hệ thống.

Tại sao cần sử dụng ammonium acetate cấp LC-MS?

Ammonium acetate là phụ gia đệm có tính bay hơi, phù hợp với nhiều phương pháp sắc ký ghép khối phổ. Sử dụng đúng cấp LC-MS giúp giảm nguy cơ phát sinh nền ion hoặc tạp chất không mong muốn.

Xem thêm: Ammonium acetate LC-MS Merck 5.33004 .

Lưu ý an toàn khi phân tích Auramine O

Người thực hiện phải được đào tạo về vận hành hệ thống LC-MS/MS, xử lý dung môi hữu cơ, sử dụng acid, pha chất chuẩn và thu gom chất thải nguy hại.

• Thao tác với acetonitrile, formic acid và acetic acid tại khu vực thông thoáng hoặc tủ hút.
• Sử dụng đầy đủ kính, găng tay và áo bảo hộ phòng thí nghiệm.
• Tham khảo SDS mới nhất trước khi sử dụng hóa chất và chất chuẩn.
• Không xả dung môi hoặc chất thải chứa Auramine trực tiếp vào hệ thống thoát nước.
• Quản lý chất chuẩn và chất thải theo quy định an toàn của đơn vị.

Giải pháp hóa chất và vật tư LC-MS tại ICG Scitech

ICG Scitech hỗ trợ tư vấn các nhóm sản phẩm phục vụ xây dựng phương pháp phân tích Auramine O:

• Chất chuẩn phân tích Auramine .
• Nước dùng cho sắc ký cấp LC-MS .
• Acetonitrile hypergrade cho LC-MS .
• Ammonium acetate và phụ gia pha động .
• Formic acid và acetic acid phù hợp cho phân tích sắc ký.
• Muối, ống và vật tư QuEChERS.
• PSA, C18 dSPE và vật tư làm sạch mẫu.
• Màng lọc syringe và vial LC-MS.
• Cột sắc ký pha đảo C18.

Việc lựa chọn mã hàng cần căn cứ vào SOP, nền mẫu, thiết bị, cấp độ tinh khiết, quy cách đóng gói và yêu cầu truy xuất COA/SDS của phòng thí nghiệm.

Kết luận

Xác định Auramine O trong thực phẩm bằng LC-MS/MS là giải pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao để kiểm soát chất vàng ô trong các nền mẫu phức tạp. Quy trình sử dụng acetonitrile acid hóa để chiết mẫu, muối QuEChERS để phân lớp, C18 dSPE để làm sạch và chế độ MRM để định lượng, xác nhận Auramine O.

Để bảo đảm độ tin cậy của kết quả, phòng thí nghiệm cần kiểm soát chất lượng dung môi, chất chuẩn, mẫu trắng, đường chuẩn, độ thu hồi, hiệu ứng nền, thời gian lưu, tỷ lệ ion và carry-over. Các điều kiện trong bài mang tính tham khảo và phải được xác nhận hoặc thẩm định trước khi áp dụng cho hoạt động thử nghiệm chính thức.

Bài viết và sản phẩm liên quan

• Phân tích Auramine O trong sầu riêng bằng LC-MS/MS
• Auramine analytical standard 51362 – chất chuẩn Auramine Merck
• Water LC-MS Merck 1.15333 – nước LC-MS LiChrosolv®
• Acetonitrile LC-MS Merck 1.00029 – hypergrade LiChrosolv®
• Ammonium acetate LC-MS Merck 5.33004 – LiChropur™
• Danh mục hóa chất và vật tư quang phổ khối Merck